ThermoFisherQuantStudio3D是另一个经典的芯片式数字PCR平台，其基本的检测流程是：将反应液加入到涂布器中，通过涂布器将反应液均匀涂布在有20000个微孔的芯片上，将芯片放在PCR仪上扩增，将芯片放入读取仪中采取拍照的方式读取荧光信号。操作较为复杂，整个过程在封闭的芯片中进行，污染的风险较低。STILLANaica是一个较新的数字PCR平台，基本的检测流程是：将反应液加入芯片，将芯片放入微滴生成扩增系统，生成30,000个微滴单层平铺于芯片中，PCR扩增在芯片上完成。然后将扩增后的芯片转移至微滴阅读分析系统，采取拍照的方式读取荧光信号。由于整个过程在封闭的芯片中进行，污染的风险较低。数字PCR是直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的定量。上海医疗系统认证数字PCR技术

根据泊松分布的定义和适用条件可知，如果我们设微液滴总数为N，投入的靶序列拷贝数为M，那么“每个微液滴中的靶序列拷贝数”的概率分布是近似满足泊松分布的。理解之前，首先要明确一点，在检测的过程中，并不是说一个样本中检测到了几个亮点，这个反应当中就有几个目标基因的拷贝。因为目标基因的片段，在微滴当中的分布，是符合泊松分布的（也就是说进不进的概率相等，并且相互独立）。所以，一个发光的微滴中，可能有一个或者三个四个，甚至更多个目标基因的拷贝。因此，发光的微滴数与原始的基因拷贝数并不是一对一的对应关系。上海医疗系统认证数字PCR技术模板 DNA 量越多，荧光达到域值的循环数越少，即 Ct 值越小。

基于微滴的QX100dPCR仪，利用油包水技术，将样品平均分配到20000个微滴油包水中，利用微滴分析仪对微滴进行分析。2012年RainDance公司推出了RainDropdPCR仪，在高压气体驱动下，将每个标准反应体系分割成包含100万至1000万个皮升级别微滴的反应乳液。数字PCR就形成了2大派别，芯片式和微滴式。不论是哪种数字PCR，其原理都是有限稀释，终点PCR和泊松分布。将含有核酸模板的标准PCR反应体系，平均分配成几万个PCR反应，分配到芯片或微滴中，使每个反应中尽可能含有一个模板分子，进行单分子模板PCR反应，通过读取荧光信号的有或无进行计数，经过统计学泊松分布的校准进行定量。

dPCR在使用过程中需要特别注意体积误差造成的结果偏差。体积误差对于测量拷贝数浓度会产生偏差。目前dPCR中体积优化方法以光学显微镜观测为主。分散体积的差异会增加拷贝数结果的不确定性，Emslie等使用光学显微镜纵向拍照比较图片边缘的微小差异，考察了数字PCR系统中每个微孔内和孔与孔间的体积差异对实验结果的影响程度。Corbisier等使用微滴数字PCR对6种不同质量分数棉籽粉质粒DNA标准物质[ERM-AD623a-f，浓度范围（10~10）copies/ul]进行分析，优化了液滴体积得到相应校正因子，并使用该校正因子发现并校准了运行软件中液滴体积不变的假设而引起的数据偏离，数据结果的一致性有明显提高。检测结果部分为阳性，部分为阴性，之后进行分子数统计，不需做标曲。

Drop-off实验包括两个针对相同扩增子的TaqMan探针：与野生型序列互补而与突变位点不发生互补的Drop-off探针和与突变型和野生型基因都互补的Reference探针（如图1A）。在野生型等位基因的存在下，Drop-off探针和Reference探针都将与目标杂交，产生双重阳性信号（如图1B，蓝色群）。相反，如果存在突变的等位基因，即使一个核苷酸的突变也会阻止Drop-off探针与之杂交，因此只有Reference探针对目标基因进行退火，从而得到一个阳性信号。三重ddPCR检测体系存在的问题：不同位点检测体系之间的cross-reactivity。广州进口数字PCR市场前景

国产dPCR企业在上述应用领域不断与伯乐、赛默飞、罗氏、凯杰、因美納等头部企业展开竞争，抢占市场份额。上海医疗系统认证数字PCR技术

20世纪末，Vogelstein等提出数字PCR(digitalPCR，dPCR)的概念，通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元至少包含一个拷贝的目标分子(DNA模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。PCR实际上是一个在模板DNA、引物(模板片段两端的已知序列)和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应，扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。上海医疗系统认证数字PCR技术

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